Skip to content

Mutacje trombomoduliny w nietypowym zespole hemolityczno-mocznicowym ad 6

3 miesiące ago

524 words

W badaniach dotyczących wytrącania stwierdzono specyficzne wiązanie CFH i C3b z trombomoduliną (Figura 3B i 3C). Po unieruchomieniu preparatów błon komórkowych komórek HEK293 eksprymujących trombomodulinę typu dzikiego lub warianty trombomoduliny związane z atypowym zespołem hemolityczno-mocznicowym, zmierzono wiązanie biotynylowanego CFH lub C3b z zastosowaniem testu immunoenzymatycznego związanego z enzymem. Niespodziewanie wiązanie CFH i C3b do wszystkich wariantów trombomoduliny, z wyjątkiem D486Y, było znacznie zwiększone w porównaniu z wiązaniem z trombomoduliną typu dzikiego (Figura 3D).
Inaktywacja trombomoduliny i C3b
Figura 4. Figura 4. Inaktywacja czynnika dopełniacza C3b przez czynnik dopełnienia I, jako ułatwiony przez trombomodulinę. Panel A jest schematycznym przedstawieniem cięcia i konwersji C3b do jego inaktywowanej postaci (iC3b) przez CFI w obecności kofaktorów (CFH, C4bBP). Po prawej stronie znajduje się Western blot zredukowanych oczyszczonych C3b i iC3b, ujawniające fragmenty składników. Reakcje przeprowadzono z oczyszczonymi białkami (panele B i C). Po 90 minutach reakcji w roztworze z oczyszczonymi białkami, reakcje rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie metodą Western blot z przeciwciałami anty-C3. Zwiększenie stężenia trombomoduliny spowodowało większą inaktywację C3b (mniej . i więcej . 2), jak określono ilościowo za pomocą densytometrii trzech plamek (Panel B). Stosując to samo podejście, trombomodulina znacząco zwiększyła również aktywność kofaktora C4bBP w inaktywacji C3b za pośrednictwem CFI (panel C). T bary oznaczają błędy standardowe. Zobacz Glosariusz, aby uzyskać wyjaśnienie składników dopełniacza.
Następnie badaliśmy, czy wzmocnione wiązanie z wariantami trombomoduliny było związane ze zmianami w funkcjonalnym związku tych białek. Aktywność trombomoduliny w regulacji dopełniacza w roztworze została przetestowana przez inkubację rekombinowanej trombomoduliny z kombinacjami C3b, CFI i CFH lub C4bBP (kofaktory CFI) (Figura 4). Trombomodulina nasilała inaktywację C3b za pośrednictwem CFI w sposób zależny od dawki w obecności CFH lub C4bBP (Figura 4B i 4C). Zgodnie z oczekiwaniem, nie było cięcia C3b przez CFI pod nieobecność kofaktora (dane nie pokazane).
Ryc. 5. Ryc. 5. Wpływ mutacji trombomodulinowych związanych z nietypowym zespołem hemolityczno-mocznicowym na inaktywację czynnika dopełniacza C3b i aktywację prokarboksypeptydazy osoczowej B (TAFI). Komórki HEK293 stabilnie transfekowano dla równej ekspresji wariantów typu dzikiego i trombomoduliny. Inaktywacja C3b za pośrednictwem CFI w obecności CFH (panel A) lub C4bBP (panel B) została oceniona metodą Western blotting, a densytometria została przeprowadzona w celu pomiaru wytwarzania nieaktywnego fragmentu cięcia (iC3b) . 2 w stosunku do komórek kontrolnych. transfekowane pustym wektorem. Zmutowane formy trombomoduliny były znacznie mniej skuteczne niż trombomodulina typu dzikiego w ułatwianiu za pośrednictwem CFI inaktywacji C3b w obecności CFH. Tylko wariant P501L wykazywał defekty aktywności kofaktora C4bBP. Wytwarzanie TAFIa zależnej od trombiny i trombomoduliny określono przez inkubację TAFI i trombiny w komórkach HEK293 eksprymujących trombomodulinę (Panel C)
[hasła pokrewne: karta dawcy szpiku, osteopatia poznan, oligobiopsja ]

Powiązane tematy z artykułem: karta dawcy szpiku oligobiopsja osteopatia poznan